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英国365集团官网LCMS-TQ9200液相色谱串联质谱系统测定呕吐毒素及其乙酰化衍生物

方案概述

前言：

呕吐毒素（脱氧雪腐镰刀菌烯醇，DON）及其乙酰化衍生物 3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇（3-ADON）、15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇（15-ADON），均由镰刀菌属真菌产生，是全球谷物中普遍存在的真菌毒素。三者均通过抑制蛋白质合成干扰细胞功能，3-ADON 和 15-ADON 毒性更强、亲脂性更高，三者还会干扰免疫功能。虽急性致癌性弱于黄曲霉毒素 B₁，但因污染广、协同危害大，被列为食品安全重点监控对象，在小麦、玉米等谷物及制品中检出率高，且常共存污染。

这类毒素的污染多因谷物生长期低温多雨或储存时水分过高，导致镰刀菌繁殖产毒。三者化学性质稳定，常规加工难以破坏，且乙酰化衍生物可能转化为 DON，加剧残留风险。人体摄入后，短期会出现恶心、呕吐、腹痛腹泻等消化道症状，3-ADON 和 15-ADON 引发的症状更剧烈；长期低剂量摄入则持续损伤免疫功能，影响儿童生长发育，对孕妇、老人及免疫力低下人群危害更显著。

本应用方案参考《GB 5009.111-2016 食品安全国家标准食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的测定》对DON、3-ADON、15-ADON的检测方法，依托英国365集团官网LCMS-TQ9200液相色谱串联质谱系统，建立了三者的同位素稀释液相色谱-串联质谱检测方法。该方法可实现目标物的精准分离与同步定量，为食品中此类毒素的检测提供可靠技术支持。

关键词：真菌毒素；呕吐毒素；液相色谱-串联质谱。

1.仪器设备及试剂

1.1 仪器配置

表1 仪器配置清单表

序号	名称	数量
1	LCMS-TQ9200液相色谱串联质谱系统	1台
2	P3500B 二元高压恒流泵	1台
3	CT3500 柱温箱	1台
4	AS3500 超高效自动进样器	1台
5	SmartLab CDS 2.0色谱工作站	1套
6	C18 2.7 μm 2.1x100 mm	1个
7	SPE HLB（200mg/6mL)固相萃取柱	若干

1.2 试剂及标准品清单

表2 试剂及标品清单表

序列	试剂及标准品	纯度
1	甲醇	LC-MS级
2	乙腈	LC-MS级
3	甲酸	LC-MS级
4	脱氧雪腐镰刀菌烯醇	100 ppm
5	3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇	100 ppm
6	15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇	100 ppm
7	3-乙酰基脱氧雪腐镰刀菌烯醇-[¹³C₁₇]（¹³C-3-ADON）	25 ppm
8	脱氧雪腐镰刀菌烯醇-[¹³C₁₅]（¹³C-DON）	25 ppm

1.3 实验材料及辅助设备

涡旋混合器；

高速离心机；

分析天平；

离心机；

固相萃取装置（带真空泵）；

氮吹仪；

摇床。

2.实验方法

2.1 溶液配制

2.1.1 0.05%甲酸水溶液：取0.5mL甲酸加入到1000mL水中，混匀。

2.1.2 0.05%甲酸乙腈溶液：取0.5mL甲酸加入到1000mL乙腈中，混匀。

2.1.3 乙腈-水溶液(84+16)：量取160mL水加入到840mL乙腈中，混匀。

2.1.4 乙腈饱和的正己烷溶液：量取200mL正己烷于250mL分液漏斗中，加入少量乙腈，剧烈振摇数分钟，静置分层，弃去下层乙腈层即得。

2.1.5 甲醇-水溶液(5+95)：量取5mL甲醇加入到95mL水中，混匀。

2.2 样本前处理

2.2.1 样品提取

取小麦粉过2 mm孔径试验筛，称取2ｇ试样（精确至0.01 g）于50 mL离心管中，加入800 μＬ同位素内标工作液（500 ng/mL)振荡混合后静置30 min。加入20 mL乙腈-水溶液(84+16)，涡旋混匀，摇床中振荡20 min，在10000 r/min下离心5 min，取上清液备用。

2.2.2 样品净化

取5mL上清液置于50mL离心管中，加入10mL乙腈饱和正己烷溶液，涡旋混合2min，5000r/min离心2min，弃去正己烷层后，于40 ℃~50 ℃下氮气吹干，加入4mL水充分溶解残渣，待净化。将固相萃取柱连接到固相萃取装置，先后用3mL甲醇和3mL水活化平衡。将4mL上述水复溶液上柱，控制流速为每秒1滴~2滴。用3mL水、1mL 5%甲醇-水溶液依次淋洗柱子后彻底抽干。用4mL甲醇洗脱，收集全部洗脱液后在40℃~50℃下氮气吹干。加入1.0mL初始流动相溶解残留物，涡旋混匀10s，用0.22μm 微孔滤膜过滤于进样瓶中，待进样。

2.3 实验条件

2.3.1 液相方法条件

色谱柱：C18 2.7 μm 2.1x100 mm；

流动相：A相： 0.05%甲酸水溶液；B相：0.05%甲酸乙腈溶液；

流速：0.35mL/min；

柱温：40 ℃；

进样体积：10 µL。

2.3.2 质谱方法条件

表5 化合物质谱参数

化合物名称	前体离子(m/z)	产物离子(m/z)	碰撞能量CE
DON	297.1	249.1*	14
DON	297.1	231.1	17
3-ADON	339.1	231.1*	18
3-ADON	339.1	203.1	25
15-ADON	339.1	137.1*	21
15-ADON	339.1	321.1	12
¹³C-DON	312.1	263.1*	14
¹³C-DON	312.1	245.1	15
¹³C-3-ADON	356.1	245.1*	20

注：带*为定量离子

3.实验结果

3.1 标准品谱图

8分钟内完成DON、3-ADON、15-ADON、¹³C-DON、¹³C-3-ADON的检测，如图1 化合物峰有良好的峰形，其响应良好，符合实验测定需求。

图1 DON、3-ADON、15-ADON、¹³C-DON、¹³C-3-ADON的色谱图

3.2 线性范围

准确移取适量DON、3-ADON、15-ADON标准工作溶液和¹³C-DON、¹³C-3-ADON混合同位素内标工作溶液，用初始流动相配制成标准曲线，DON、3-ADON、15-ADON线性范围为5-640 ng/mL，其中包含100 ng/mL的同位素内标，DON以¹³C-DON作为内标校正和3-ADON、15-ADON以¹³C-3-ADON作为内标校正后，DON、3-ADON、15-ADON线性结果与已知浓度的偏差小于最大允许偏差，R²均大于0.995，线性关系良好。

图2 DON、3-ADON、15-ADON标准曲线

3.3 定量限与检出限

本方法以5 ng/mL、10 ng/mL分别作为DON、3-ADON、15-ADON的检出限和定量限，其信噪比如下表，检出限信噪比均大于3，定量限信噪比均大于10。

表6 定量限与检出限

化合物名称	检出限信噪比（5 ng/mL）	定量限信噪比（10 ng/mL）
DON	8.9	16.35
3-ADON	18.972	37.389
15-ADON	59.148	108.855

3.4 重复性

取10、40、320 ng/mL三种浓度标准溶液，连续进样6针。结果如下表所示，高中低浓度 DON、3-ADON、15-ADON保留时间，样品量的相对标准偏差均在5%以内，满足实验要求。

表7 高中低浓度 DON、3-ADON、15-ADON重复性测试

化合物	浓度(ng/mL)	峰面积RSD（%）	保留时间RSD（%）
DON	10	2.252	0.290
	40	3.168	0.327
	320	0.718	0.268
3-ADON	10	1.807	0.153
	40	1.718	0.179
	320	1.292	0.135
15-ADON	10	2.049	0.159
	40	2.623	0.235
	320	4.121	0.107

3.5 加标回收

在样品A中加入标准溶液，使DON、3-ADON、15-ADON浓度增加20 ng/mL，进液质测试，连续6针进样测试，回收率与RSD符合实验要求。

表8 回收率

化合物	回收率	RSD
DON	98.81%	3.37%
ADON	105.39%	4.17%
15-ADON	116.11%	2.19%

3.6 空白残留

在进样640 ng/mL标液后，进样一针单空白（初始溶剂加内标），计算空白残留，结果如图3，空白残留未检出。

图3 化合物空白色谱图

3.7 样品测定

样品A（图4）检出DON含量为14.4 ng/g，未检出3-ADON、15-ADON。

图4 样品A的 DON、3-ADON、15-ADON色谱图

4.结论

本方法使用英国365集团官网LCMS-TQ9200液相色谱串联质谱系统建立呕吐毒素（脱氧雪腐镰刀菌烯醇，DON）及其乙酰化衍生物 3-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇（3-ADON）、15-乙酰脱氧雪腐镰刀菌烯醇（15-ADON）的同位素稀释液相色谱-串联质谱法检测方法。由数据可得该方法的各色谱峰峰形良好、无拖尾，灵敏度符合国标要求，R²均大于0.995，符合线性要求，高中低浓度的重复性在5%以内，高浓度样本无系统残留，说明了该方法配备英国365集团官网液相色谱质谱联用系统满足对待测样本的常规性定性定量检测需求。

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